精液染色技术及形态分析
精子正常形态
（a、b）：体外结合于透明带的精子，Shorr染色；
（c）：性交后宫颈粘液中的精子，巴氏染色。
涂片的制作与染色
每份新鲜的精液标本应制备2张以上的涂片。
每次取样前要充分混匀精液。
对于未稀释的精液，采用拉薄技术；对于已洗涤的精液，采用移液管法。
要用铅笔做记号，记号笔会脱色。
染色时2张涂片背靠背，使染色时间一致。用水冲洗已染色的涂片的力度和时间也要尽量一致。
（a）未经稀释的精液的涂片方法；
（b）洗涤后的精子悬液的涂片方法。
在精液液滴之前“拉”，而不要在液滴之后“推”
精液涂片的厚度，影响因素有：
液体的体积(10 µl)…………体积越小，则精子分散越好
拉片的角度( 45°)…………角度越大，则涂片越薄
涂片的速度(~1 秒)…………速度越高，则片子越厚
空气干燥的精液涂片，如果固定会出现的缺点：
脱水…………………………比湿片小
剪切力………………………不成熟的精子头膨胀
渗透损伤……………………胞浆小滴的丢失，过多的残余胞浆滞留
推荐采用Papanicolaou、Shorr或Diff-Quik染色法。
使用光学显微镜观察，精子头部顶体区为浅蓝色、顶体后区为深蓝色，中段略呈红色，尾部为蓝色或红色。残余的胞浆小滴染成粉红色或橙红色。
3种染色方法的选择
若采用人工分析精子形态，建议用巴氏染色法，涂片可以永久保存，符合质控要求。
Diff-Quik染色法适合CASA，只有3个步骤，用时不足一分钟，但涂片不能保存。所以CASA必须能够保存每条精子的形态图片，而且要有图像回放功能才符合质控要求。
Shorr染色法与巴氏染色的效果近似，步骤较少，涂片可以长期保存，适合人工分析。
改良巴氏染色
有20个步骤，耗时40-60分钟。脱色时间长短影响染色强度。染色背景较浅。
Diff-Quik染色
有4个步骤，耗时1-2分钟。仅精子表面着色，对细胞膜影响小。背景较深。
精子形态
正常精子形态
精子头部长度为4.0-5.0um,
宽度为2.5-3.5um,
长宽之比为1.50-1.75，
顶体界限清晰，占头部的40%-70%，
中段稍细，宽度<1um,约为头部长度的1.5倍，
尾部直，均一，比中段细，非卷曲，长度约为45um，
形态异常精子
1.畸形精子：头部畸形、中段偏厚、双尾
2.畸形精子：头部畸形、中段畸形
3.畸形精子：梨形头、中段弯曲、不规则、胞浆小滴过多
4.畸形精子：头部畸形
5.畸形精子：梨形头
6.畸形精子：头部畸形
形态异常精子
19畸形精子：头部畸形、空泡数>2
20.畸形精子：头部正常、顶体>70%
21.畸形精子：头部畸形、顶体>70%.
22.畸形精子：头部畸形、顶体<40%
23畸形精子：头部畸形、顶体<40%
对于头部异常的描述
对于颈和中段异常的描述
对于主段异常的描述
非精子细胞
未评估精子
精子多重缺陷的指标
畸形精子指数（the teratozoospermia index ，TZI)=缺陷总数/缺陷精子数
精子畸形指数（the sperm deformity index ，SDI)=缺陷总数/精子总数
TZI等于1表示每个异常精于只有一种缺陷，TZI等于3则表示每个异常精子都有头部、中段和尾部缺陷。所以，TZI反映的是每个精子的缺陷程度，是针对每个精子个体而言，而精子密度、活动率、前向活动率和正常形态以及SDI是就每一份精液的整体而言。
要提醒注意的是，畸形精子指数的数值介于1．00和3．00之间。以前的报道提示，"TZI>1.6与未经治疗不育夫妇的低生育率有关，而且SDI 1.6是体外受精失败的阈值。这些参数预示精子在体内和体外的功能情况。
例：使用六键计数器每次计数200条精子。在第1次计数时，42条正常158条异常。在158条异常精子中，140条有头部缺陷，102条有颈部缺陷，30条有尾部缺陷，44条有多余的胞浆小滴残留。在第2次计数时，36条正常，164条异常。其中122条有头部畸形，22条颈部畸形，36条有多余的胞浆小滴。计算TZI时，用总的畸形数(140+102+30+44+122+108+22+36 = 604畸形)除以异常精子数(158+164 = 322), TZI = 604/322 = 1.88；SDI= 604/400=1.51 。
计算机辅助精子形态学计量分析的优势
CASA的影像分析使精子形态学分析评估量化，能获得更多的精子特征参数。
自动分析系统比手工操作具有更好的客观性、精确性和可重复性，变异系数＜7%, 甚至比熟练的操作人员更精确。
面对门诊量巨大，人力不足的情况，还要把精子形态学分析列为常规检查，同时执行严格的质控措施，确实有许多困难。使用CASA是最好的出路（可任意选择15%标准或4%标准）。